Todo o material utilizado no laboratório deve ser cuidadosamente limpo, afim de se evitar a presença de contaminantes que vão influenciar no resultado final. Após o uso, devem ser mantidos em uma solução de detergente a fim de evitar a impregnação de reagentes.

Vários detergentes são encontrados no mercado para este fim e devem ser usados conforme as instruções de uso dos fabricantes. As causas mais comuns de imperfeições na limpeza, são restos de detergentes e gorduras. No caso de gorduras, quando em grande quantidade, emprega-se um solvente orgânico (ex. éter de petróleo) seguido de lavagens com água e com um agente oxidante. O oxidante mais empregado para a remoção de gorduras, detergentes, amostras, etc. é a solução sulfocrômica.

Solução Sulfocrômica

Dissolver 50g de Bicromato de Potássio em 50mL de água. Adicionar lentamente, 800mL de Ácido Sulfúrico concentrado, com agitação constante e em banho de água e gelo. Conservar a solução em frasco bem vedado.

Manipular com os cuidados inerentes à solução ácida.

Após a lavagem com detergente, enxaguar com água corrente e deixar o material em contato com a solução sulfocrômica de 1 a 24 horas, dependendo da quantidade de resíduos existentes. Retirar a vidraria da solução e lavar no mínimo 5 vezes com água deionizada.

A solução sulfocrômica pode ser usada várias vezes. Descartar quando adquirir cor esverdeada.

A vidraria  a ser utilizada na determinação de ferro, cálcio, magnésio, cobre e outros, deve ser deixada de molho em solução de ácido clorídrico (HCl) a 50% ou em ácido nítrico (HNO3) a 30%. Posteriormente esta vidraria deverá ser enxaguada inúmeras vezes em água corrente e água deionizada.

02- Quais as especificações da água reagente a ser utilizada no laboratório?

A água corrente não é apropriada para a preparação de reagentes. Dois processos são empregados na obtenção de água purificada: destilação e deionização.

·  Critérios do NCCLS para definição de água reagente:

	Tipo I	Tipo II	Tipo III
pH	NA	NA	5,0 – 8,0
Silicatos mg/L (max)	0,005	0,1	1,0
Resistividade (megohm/cm)	10	2,0	0,1
Bactérias UFC/mL (máximo)	10	103	NA
Matéria Orgânica	Próximo de zero	NA	NA
Partículas	<0,2µm	NA	NA

NCCLS - National Commitee for Clinical Laboratory Standards

Utilização e Armazenamento da Água Reagente

	Tipo I		Tipo II		Tipo III
Aplicação da água reagente	Utilizada em teste que requer o máximo de precisão. Ex.: Reconstituição de soros controles e calibradores Dosagem de traços de elementos. Enzimologia Ensaios de ligação		Uso geral em laboratório e na maioria dos procedimentos em bioquímica, imunologia, hematologia.		Lavagem de vidraria Preparo de meio de cultura.
Armazenamento		Não deve ser armazenada, pois sua obtenção só ocorre no momento da coleta. A água Tipo I, deve ser produzida e utilizada imediatamente.		Não deve ser armazenada por um período superior a 01 semana. Lavar bem o recipiente, a cada troca de água. Utilizar recipientes adequados como os de vidro.	Não deve ser armazenada por um período superior a 01 semana. Lavar bem o recipiente, a cada troca de água. Utilizar recipientes adequados como os de vidro.

03-   Quais os principais interferentes responsáveis por resultados elevados nas dosagens de eletrólitos?

Os principais interferentes nas dosagens de eletrólitos são: uso de vidraria lavada inadequadamente e água inadequada para preparo de reagentes.

04-   Os resultados de glicemia de jejum e hemoglobina glicosilada são sempre correlacionáveis?

Não. A dosagem de hemoglobina glicosilada reflete o controle metabólico do paciente nas 8 – 10 semanas precedentes ao teste, enquanto que a glicemia de jejum reflete o controle somente das 24 horas anteriores.

Sendo assim, é possível obter uma glicemia de jejum dentro dos valores de referência e uma hemoglobina glicosilada elevada em pacientes diabéticos não controlado. 

05-    Por que razão em alguns casos, imediatamente após o preparo, o reagente de cor dos kits de Colesterol 250, Urato 160, Glucox 500 e  Triglicérides 120,  adquire coloração rosada?

Tal fato ocorre devido a presença de substâncias oxidantes na água utilizada que promovem a oxidação da 4-Aminoantipirina formando o produto rosado 4-Antipirilquinomina. A intensidade de cor formada é proporcional a quantidade de substâncias oxidantes presente na água utilizada.

06-   É preciso determinar fator todos os dias? Qual a frequência ideal?

De um modo geral, os fatores devem ser determinados sempre que for adquirido um novo lote.

Para kits totalmente colorimétricos o fator deve ser determinado quando da abertura do kit.

Para kits enzimáticos colorimétricos o fator deve ser determinado a cada semana ou a cada nova reconstituição da enzima.

Deve ser feita uma verificação diária do estado de controle do ensaio. É importante lembrar que de acordo com a BPLC – Boas Práticas de Laboratório Clínico, o monitoramento do ensaio deve ser feito utilizando-se 02 soros controle com níveis diferentes de concentração.

Os resultados destes soros devem ser registrados diariamente em uma planilha e  plotados nos mapas de Levey-Jennings.

07-   Pode-se dosar microalbuminúria com o kit de Microprote?

Não. O kit de Microprote Doles utiliza o corante Coomassie azul brilhante para detectar quantidades mínimas de proteínas. Esse corante forma um complexo corado com albumina e diferentes variedades de proteínas de globulinas, reagindo integralmente com todas proteínas existentes na urina ou líquor.

08-   O desenvolvimento de cor ligeiramente castanha nos reagentes enzimáticos colorimétricos, com o passar do tempo, indica perda de estabilidade do mesmo?

Não. Em reativos enzimáticos colorimétricos com leitura em 510nm, o máximo de absorbância tolerável ao branco do reativo é de 0,150, com leitura realizado contra um branco representado por água destilada ou deionizada. 

09-   Qual a diferença entre metodologias com reações colorimétrica enzimática/química, enzimáticas e ultravioleta?

Reações colorimétricas
O produto formado é corado com leitura na faixa do espectro visível. Estas reações podem ser de ponto final ou cinética.

Reações ultravioletas
O produto formado não é corado, não há “visualização da reação” como nas reações colorimétricas.  O produto da reação absorve energia radiante na faixa ultravioleta. Estas reações podem ser de ponto final ou cinética.

Reações de ponto final
São reações cuja concentração máxima do produto, quando atingida, permanece inalterada por um determinado tempo. A estabilidade do produto formado está diretamente relacionada às características dos reagentes utilizados na reação. Tais reações podem ser colorimétricas (Triglicérides 120, Colesterol 250, Urato 160, etc...) ou ultravioletas (Fosfato UV).

Reações cinéticas
São reações em que se mede a formação de produto em intervalos de tempo pré-estabelecido. Em alguns casos a formação do produto está diretamente relacionada à temperatura. Sendo assim, tais reações cinéticas devem ser realizadas preferencialmente em aparelhos que possuam cubetas termostatizadas, a fim de se obter resultados mais precisos. Ex. ALTUV, ASTUV, DHLUV, Amilase CNPG, GamaGT Cinética.

10-   Às vezes na dosagem de bilirrubina não há formação de cor ou ainda ocorre a turvação da reação. A que se devem tais ocorrências?

A conservação da amostra a ser utilizada na dosagem de bilirrubina é  fator de grande importância, pois a bilirrubina é extremamente fotossensível, devendo o soro ser mantido ao abrigo da luz.

Quando os níveis de bilirrubinas estão elevados deve-se utilizar a técnica micro. Por outro lado, em amostras cujo aspecto não seja icteríco, deve-se utilizar técnica macro.

O uso de plasma cujo sangue foi colhido com anticoagulante à base de EDTA é contra-indicado. O sal EDTA reage com o Benzoato de Sódio contido na solução aceleradora, formando-se Ácido Benzóico. Este, insolúvel, precipita-se e turva a solução. À leitura no espectrofotômetro teremos resultados falsamente elevados.

A ordem de adição dos reagentes indicada no procedimento técnico, deve ser seguida rigorosamente, pois se não houver a formação do diazo-reagente a formação de cor fica comprometida.

11-   Quais critérios devem ser adotados na execução de testes de látex Gestatest , PCRTEST, ASLOTEST, REUMATEST, com resultados de qualidade?

A lâmina utilizada na reação deve estar rigorosamente limpa e isenta de gordura, pois resíduos de detergente podem interferir nos resultados. È aconselhável que antes da realização do teste a lâmina seja desengordurada com álcool, cuja completa evaporação deve ser observada.

A agitação deve ser feita em condições padronizadas, a fim de que se obtenham resultados comparáveis em diferentes provas.

O congelamento do látex leva a reações inespecíficas de aglutinação. Os frascos de látex devem permanecer bem fechados, caso contrário poderão ocorrer floculações.

As proporções dos reagentes devem ser seguidos rigorosamente.

O tempo de leitura deverá ser preciso. Após o tempo de leitura e com a exposição da placa de reação ao ar pode haver dessecação do látex com a presença de resultados inespecíficos.

12-   Qual a diferença entre os kits de RPRtest , VDRL e Sifilistest? E quais os critérios utilizados na execução dos testes de RPR ou VDRL com qualidade?

Ambos são utilizados no diagnóstico da sífilis. Os testes sorológicos são classificados em Treponêmicos e Não Treponêmicos.

Testes Não Treponêmicos - VDRL e RPRTEST

São utilizados comumente para a triagem. Detecta anticorpos IgG e IgM para um antígeno cardiolipina-lecitina-colesterol.

VDRL Doles é uma suspensão alcoólica de colesterol, cardiolipina bovina e lecitina.

RPRTEST Doles o antígeno é uma suspensão de micropartículas de carbono sensibilizadas com lipídios complexos que se aglutinam na presença de reaginas. O RPRTEST SÍFILIS Doles dispensa o preparo da suspensão antigênica. O antígeno está pronto para uso – é conhecido também como VDRL pronto para uso.

Para padronização dos antígenos de VDRL e RPRTEST sugerimos a rígida observação dos seguintes critérios

· Titulação diária do controle positivo, para verificar perda de sensibilidade do antígeno, ou erros nas etapas do procedimento técnico.

· Verificar o tempo de reação especificado na instrução de uso do kit.

·  Não alterar os volumes indicados para preparar o antígeno. KIT DE VDRL.

· Utilizar os reagentes preparados dentro do prazo especificado.

· A agitação deve ser feita em condições padronizadas, para que sejam obtidos resultados comparáveis em diferentes provas.

· Manter os reagentes acondicionados conforme especificação na instrução de uso.

· Manter os técnicos do laboratório treinados e atualizados.

· Testar todas as amostras na diluição de 1:1 e 1:10 para evitar resultados falso-negativos, devido ao efeito pró-zona.

· Antes da execução dos testes o antígeno deve ser testado, com um soro negativo não turvo. É fundamental estabelecer um padrão de floculação (positivo e negativo) para cada kit utilizado.

· Lembramos ainda que a literatura científica e a CN-DST e AIDS (Coordenação Nacional de DST e AIDS) aceita a variação de um título acima ou abaixo, em uma mesma amostra testada em diferentes laboratórios ou por diferentes pessoas.

Testes Treponêmicos – Sifilistest Doles (TPHA) e FTA-ABS

Os testes treponêmicos são utilizados como testes confirmatórios para os soros reativos nos testes de  triagem.

O sifilistest Doles é um teste de Hemaglutinação indireta para detecção qualitativa e semi-quantitativa de anticorpos anti Treponema Pallidum.

Sensibilidade dos Testes Sorológicos para Sífilis nos Diferentes Estágios da Doença

	ESTÁGIO DA DOENÇA
	Primário	Secundário	Latente	Terciária
VDRL	74 – 87%	100%	98 – 100%	71%
RPR	77 – 100%	100%	95 – 100%	73%
FTA-ABS	70 – 100%	100%	100%	96%
Hemaglutinação	69 – 90%	100%	97 – 100%	94%

Estudo realizado no Center for Disease Control and Prevention, segundo Larson A S, Steiner B.M, Rudolph AH: Laboratory Diagnosis and Interpretation of tests for syphylis. Clin. Microbiology Ver. 1995; 8:1.

13- Porque se utiliza a concentração de 100mg/dL para os cálculos de colesterol HDL, uma vez que o rótulo do padrão de colesterol HDL está especificado 50mg/dL?

No item 01 do procedimento técnico, o soro é diluído 1:2 com o reagente precipitante. Na fórmula de cálculo, o resultado encontrado já é multiplicado por 2 para se ter o resultado final. Sendo assim, no cálculo do fator utiliza-se o número 100, derivado de 50 x 2.

Caso seja considerado para o cálculo do fator um padrão de 50mg/dL o resultado final deve ser multiplicado por 02. A não observação desta multiplicação levará a resultados falsamente diminuídos.

14- O que eu faço com o padrão de 50mg/dL que vêm no kit de Creatinina, uma vez que a técnica pede para que seja utilizado um padrão 5mg/dL para dosagem de creatinina sérica?

O kit de Creatinina Doles é um sistema colorimétrico de quantificação da creatinina no soro, urina e demais líquidos biológicos.

Para dosagem de creatinina sérica é utilizado um padrão de 5mg/dL que deve ser preparado no laboratório a partir do padrão de 50mg/dL. O padrão de 5mg/dL é preparado adicionando-se 200µL da solução padrão 50mg/dL a 1,8mL de albumina bovina (solução diluente – acompanha o kit). É importante nesta etapa que seja utilizada pipeta semi-automática de 200µL calibrada, para obtenção de resultados precisos. NÃO UTILIZAR PIPETA GRADUADA.

O restante do padrão de 50mg/dL deve ser guardado para ser utilizado na determinação do fator para dosagem de creatinina urinária.

15- O  kit de Creatinina Doles pode ser utilizado em modo cinético?

Sim. Para tal, proceder conforme se segue:

Preparo do Reagente de Trabalho

·  2,5mL de reagente pícrico
·  10mL de água destilada/deionizada.
·  10 gotas de solução alcalina.
· Homogeneizar e deixar repousar durante 5 minutos antes de usar.
· Após o preparo o reagente permanece estável por 07 dias, se mantido entre 2-6ºC.

Realização do teste – Creatinina

Utilizar preferencialmente aparelhos semi-automáticos ou automação completa. Solicite o manual de automação para o equipamento de seu laboratório.

·      Selecionar o comprimento de onda de 505nm.
·      Zerar o aparelho com o reagente de trabalho
·      Transferir 1mL do reagente de trabalho para um tubo de ensaio.
·      Adicionar 100mL de amostra/padrão – Creatinina Sérica; 10mL de amostra/padrão – Creatinina Urinária
·      Esperar 30 segundos.
·      Fazer a leitura inicial (A1) em absorvância.
·      Repetir a leitura (A2) 60 segundos após a primeira leitura anotar o achado.

Cálculos:

         Conc. Padrão
F = ___________
           A2 – A1

Conc. Padrão
5mg/dL – Creatinina Sérica
50mg/dL – Creatinina Urinária.

Creatinina (mg/dL) = (A2 – A1) amostra x Fator